www.uhasselt.be
DSpace

Document Server@UHasselt >
Research >
Research publications >

Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/1942/20565

Title: Development of a suitable bioreceptor for C-reactive protein: Aptamer selection, validation & sensor development
Authors: Vanbrabant, Jeroen
Advisors: Michiels, Luc
Vermeeren, Veronique
Issue Date: 2014
Abstract: Not many research areas are as evolving as biosensor research. Started in the fifties, it is now expanded to a technology-driven, multidisciplinary field with large impact on society and hence commercial interest. A myriad of applications exists for a device that very specifically and sensitively measures the presence and concentration of a target molecule of choice, e.g. in environmental monitoring (contaminants, pesticides), food analysis (pathogens, antibiotics) and especially in healthcare. Diagnostics of disease specific markers is one of the main but not the only application in the field of medicine. High-end technologies deliver biosensor devices that measure the interaction of bioreceptors or biomolecules of choice with other analytes in very high detail. These technologies provide information on affinity and moreover, on the rate of interaction. Therefore, therapeutic applications as biological activity evaluation of drugs, protein-DNA or protein-protein interactions and compound screening for new drug development have increased the performance of this research field even more. Biosensors are true examples of the multidisciplinary approach: a biological target binding element (molecular biology) on a binding signal transducing material (physics and chemistry) and the resulting biochemical or biophysical signal that is translated to a quantifiable value (engineering). The research presented in this dissertation is focused on the biological receptor element of the biosensor and on one type in particular: aptamers or selected synthetic DNA that binds very specifically to a target of choice. This dissertation starts at the onset of the development of a new biosensing application, the selection procedure. Suitable aptamers are selected that bind Creactive protein (CRP), an acute-phase protein and inflammation marker. By performing a selected and optimized SELEX procedure (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) nanomolar affinity aptamer candidates are selected and pitfalls of the SELEX selection procedure are addressed. By increasing the number of negative selection steps, reducing the number of amplification cycles and addition of non-specific single-stranded DNA (ssDNA), frequently encountered problems as non-specific binding and introduction of amplification bias are untangled. The research presented shows it is of utter importance to carefully monitor and test the applied selection conditions (target immobilization procedure, buffer compositions and applied SELEX design), preferably by different methods. An interesting tool for monitoring the selection progress is explored in this dissertation. By performing remelting curve analysis (rMCA) on the selection pools of three different SELEX set-ups, the method is proven to be very useful for monitoring SELEX conditions and dynamics in the DNA selection pool. By applying the real-time DNA amplification analysis as suggested here, the SELEX procedure and conditions are tailored in more detail, monitored and made more efficient. Detailed binding analysis of the selected aptamers is performed on different platforms, ranging from standard immunosorbent-like techniques to high-end instrumentations such as surface plasmon resonance (SPR) analysis. This has shown high affinity (nanomolar) of the aptamers for CRP when applied as they were selected: unmodified with reporter molecules and in solution over the target. This proofs aptamer functionality but also the high demands aptamers have for the proper binding conditions. This limits the versatility of the selected bioreceptors and the possible biosensor designs using this receptor to label-free homogeneous assays. The experiments performed on different read-out systems show that it is possible to optimize the aptamer functionality after the SELEX procedure with detailed binding condition optimizations on highly informative read-out systems as SPR. More ideally, aptamer versatility and flexible functionality is obtained during the selection procedure, by changing the selection conditions or by modifying a priori part of the selection library. The selected aptamers for CRP and another well validated aptamer sequence for thrombin are also used in this dissertation to test the applicability of aptamers in a recently developed read-out platform. This new platform measures the change in heat-transfer resistance over a solid-liquid interface when the binding event takes place on that interface. The experiments performed here show that the binding of the target or the selected aptamers does not result in a measurable insulation signal change in the prototype set-up. Nevertheless, indications from the work with DNA hybridization and denaturation show that target induced strand displacement is an interesting option to get this read-out system operational for aptamer applications.
Niet veel onderzoeksgebieden zijn zo snel evoluerend als biosensoronderzoek, begonnen in de jaren vijftig en uitgegroeid tot een technologie-gedreven, multidisciplinair onderzoeksveld met grote impact op de maatschappij en dus met commercieel belang. Vele toepassingen zijn mogelijk voor een instrument dat de aanwezigheid en concentratie van een relevant molecule zeer specifiek en nauwkeurig meet, bijvoorbeeld in milieuonderzoek (vervuiling, pesticiden), in voedselanalyse (pathogenen, antibiotica) en vooral in de gezondheidszorg. Diagnose van ziekte-specifieke merkers is één van de belangrijkste maar niet de enige toepassing in de geneeskunde. Hoogtechnologische instrumenten meten zeer gedetailleerd de interactie tussen biomoleculen, met informatie over de sterkte of affiniteit en de snelheid van de binding. Daarom hebben therapeutische toepassingen zoals de evaluatie van de biologische activiteit van geneesmiddelen, eiwit - DNA of eiwit - eiwitinteracties en drug screening voor de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen de performantie van dit onderzoeksgebied nog doen toenemen. Biosensoren zijn echte voorbeelden van een multidisciplinaire aanpak: een biologische receptor of bindend element (moleculaire biologie) op een signaal geleidend materiaal (fysica/chemie) en het daaruit voortvloeiende biochemische of biofysische signaal dat wordt gemeten en vertaald naar een meetbare waarde (ingenieurswetenschappen). Het in dit proefschrift beschreven onderzoek is gericht op het biologische receptorelement van de biosensor en op één type in het bijzonder: aptameren of geselecteerd synthetisch gemaakt DNA dat zeer specifiek bindt op een doelwitmolecule naar keuze. Dit proefschrift begint bij de start van de ontwikkeling van een nieuwe biosensortoepassing, de selectieprocedure. Geschikte aptameren worden geselecteerd die C - reactief proteïne (CRP) binden, een acute - fase eiwit en tevens een merker voor ontsteking en hartfalen. Door het uitvoeren van een geoptimaliseerde SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Eponential Enrichment) procedure voor enkelstrengig DNA (ssDNA), worden aptamer kandidaten met hoge affiniteit voor CRP geselecteerd en worden mogelijke problemen en valkuilen van de SELEX procedure behandeld. Door het opvoeren van het aantal negatieve selectiestappen, een daling van het aantal amplificatiecycli en de toevoeging van niet-specifieke ssDNA worden vaak voorkomende problemen als niet - specifieke binding en het invoeren van amplificatieartefacten aangepakt. Het hier gepresenteerde onderzoek toont aan dat het van het grootste belang is om de toegepaste selectiecondities (immobilisatieprocedure van het target molecule, buffercomposities en het ontwerp van de SELEX procedure) zorgvuldig te controleren en testen, bij voorkeur door verschillende methoden. Een interessante methode voor het opvolgen van de voortgang van de aptameerselectie wordt voorgesteld in dit proefschrift. Door het uitvoeren van de zogenaamde dubbele smeltcurveanalyse op de selectiepools van drie onafhankelijke SELEX procedures voor verschillende targets, is deze methode zeer nuttig gebleken voor het monitoren van selectiecondities en van de dynamiek in de verschillende selectiepools. Door het toepassen van de real-time DNA amplificatieanalyse zoals ze hier wordt voorgesteld, kan de selectiecondities en - procedure in meer detail worden geoptimaliseerd en efficiënter worden gemaakt. Gedetailleerde bindingsanalyse van de geselecteerde aptameren wordt uitgevoerd op verschillende uitleesplatformen, variërend van standaard immunosorbent-achtige technieken tot hoogtechnologische instrumentatie zoals surface plasmon resonance (SPR) analyse. Hieruit blijkt een hoge affiniteit (nanomolair) van de aptameren voor CRP, indien ze worden toegepast zoals ze zijn geselecteerd: niet gewijzigd met reportermoleculen en in oplossing gemeten. Dit illustreert de functionaliteit van de geselecteerde aptameren, maar ook de hoge eisen die de aptameren stellen voor de juiste bindingscondities. Hierdoor zijn de veelzijdigheid van de geselecteerde bioreceptors en eventuele toepassingen met deze receptor beperkt tot labelvrije, homogene tests. De experimenten uitgevoerd op verschillende uitleessystemen laten zien dat het mogelijk is om de functionaliteit van aptameren te optimaliseren na voltooiing van de SELEX procedure, met behulp van zeer gedetailleerde en informatieve systemen zoals SPR. Idealiter wordt de veelzijdigheid en flexibele functionaliteit van de aptameren al verkregen tijdens de selectieprocedure zelf, door het afwisselen van selectiecondities of door het vooraf wijzigen van de DNA selectiebibliotheek. De geselecteerde aptameren voor CRP en een ander goed beschreven aptameer voor thrombine worden gebruikt om de toepasbaarheid van aptameren te testen in een nieuw ontwikkeld uitleesplatform. Dit toestel meet de verandering in de weerstand van warmteoverdracht ofwel isolatie over een interface van vaste stof naar een vloeistof in een meetcel, wanneer binding van het biologisch target molecule plaatsvindt op deze interface. De uitgevoerde experimenten tonen aan dat de binding van het target molecule of van de geselecteerde aptameren op de interface niet leidt tot een meetbare verandering van de isolatie in dit prototype instrument. Toch duiden verschillende aanwijzingen uit DNA denaturatieexperimenten erop dat zogenaamde displacement assays, waarbij een dubbelstrengige aptameer sequentie enkelstrengig wordt onder invloed van het target, een interessante optie zijn om dit toestel operationeel te krijgen met aptameren.
URI: http://hdl.handle.net/1942/20565
Category: T1
Type: Theses and Dissertations
Appears in Collections: PhD theses
Research publications

Files in This Item:

Description SizeFormat
N/A6.63 MBAdobe PDF

Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.